Caracterización del polirribosilribitol fosfato por cromatografía de exclusión molecular de alta eficacia con detección ultravioleta / Characterization of polyribosylribitol phosphate by high efficiency size exclusion chromatography with ultraviolet detection

Haemophilus influenzae tipo b es un importante patógeno del hombre causante de varias de las enfermedades invasivas en niños menores de cinco años, contra el cual fueron autorizadas las vacunas glicoconjugadas a partir del polirribosilribitol fosfato. Quimi-Hib® es la primera y única vacuna contra este patógeno que utiliza el polisacárido obtenido por síntesis química. El Ingrediente Farmacéutico Activo es producido por el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología y se obtiene a partir de su conjugación al toxoide tetánico. En el presente reporte se hizo una caracterización del polirribosilribitol fosfato mediante la técnica de cromatografía de exclusión molecular de alta eficacia con detección ultravioleta a 215 nm. En el estudio se evaluaron tres lotes y se determinó el perfil de elución en una columna SuperdexTM 75 10/300 GL Increase con un porciento de pureza de 77,42 ± 8,97 y una masa molar promedio de 7.381 Da ± 210,93. La principal impureza presente en el polirribosilribitol fosfato es el dimetilsulfóxido, disolvente utilizado en la reacción de activación con el éster N-hidroxisuccinimidilo del ácido β-maleimidopropiónico. El polirribosilribitol fosfato se purificó por filtración con un Amicon Ultra-15 de 2.000 Da hasta una pureza de 99,1 por ciento y se conjugó al toxoide tetánico. El rendimiento de la reacción de conjugación con el polisacárido purificado fue de 30,0 por ciento 1,77 el cual no muestra diferencias significativas con el control que fue 33,7 por ciento ± 3,57 demostrándose que el dimetilsulfóxido no afecta el desempeño de la reacción de conjugación(AU)

Haemophilus influenzae type b is an important human pathogen causing some invasive diseases in children less than five years of age. Glycoconjugate vaccines based on polyribosylribitol phosphate have been licensed against this bacterium. Quimi-Hib® is the first and only vaccine against this pathogen using the chemically synthesized polysaccharide. The Active Pharmaceutical Ingredient is produced by the Center for Genetic Engineering and Biotechnology and is obtained from its conjugation to tetanus toxoid. In the present report a characterization of polyribosylribitol phosphate was performed by high performance molecular exclusion chromatography with ultraviolet detection at 215 nm. Three batches were evaluated in the study and the elution profile was determined on a SuperdexTM 75 10/300 GL Increase column with a purity percentage of 77.42 ± 8.97 and an average molecular weight of 7,381 Da ± 210.93. The main impurity present in polyribosylribitol phosphate was dimethylsulfoxide, the solvent used in the activation reaction with N-hydroxysuccinimidyl ester of β-maleimidopropionic acid. Polyribosylribitol phosphate was purified by filtration using a 2,000 Da cut-off Amicon Ultra-15 to a purity of 99.1 percent and conjugated to tetanus toxoid. The yield of the conjugation reaction with the purified polysaccharide was 30.0 percent ± 1.77 which shows no significant difference with the control which was 33.7 percent ± 3.57 demonstrating that dimethylsulfoxide does not affect the performance of the conjugation reaction(AU)

Validación del método de Ellman para la determinación de la concentración de grupos sulfhidrilos a muestras de la producción de la vacuna sintética contra el Haemophilus influenzae tipo b / Validation of Ellman's method for determining sulfhydryl group concentration in samples of the synthetic vaccine against Haemophilus influenzae type b

Se validó el método de Ellman para la determinación de grupos sulfhidrilos de la producción del Ingrediente Farmacéutico Activo de la vacuna contra el Haemophilus influenzae tipo b (Hib). Se evaluaron los parámetros: linealidad, rango de trabajo, especificidad, exactitud y precisión. El método fue lineal en el rango de 0,25-4 mM/L. Se demostró que la técnica fue específica con una exactitud entre 95 y 105 por ciento. La repetibilidad y la precisión intermedia mostraron coeficientes de variación inferiores al 5 por ciento y 10 por ciento respectivamente, por debajo de los criterios de aceptación requeridos para estos parámetros. Se estableció el reactivo hidrocloruro de L-cisteína monohidratado como control positivo del método. Este ensayo por su precisión, especificidad y exactitud se convierte en una eficaz herramienta para el controldel proceso de obtención de esta vacuna(AU)

Ellman´s method for determining sulfhydryl groups in the Haemophilus influenzae type b vaccine wasvalidated. The following parameters were evaluated: linearity and working range, specificity, accuracy andprecision. The method has proven to be linear in the range from 4 to 0.25 mM/L, it also demonstrated to bespecific with accuracy from 95 to 105%. Repeatability and intermediate precision showed coefficients ofvariation of less than 5% and 10% respectively, below the acceptance criteria required for these parameters.L-cysteine hydrochloride monohydrate reagent was established as a positive control. Taking into accountits precision, specificity and accuracy; this method becomes a necessary tool for carrying out processcontrol in order to obtain this vaccine(AU)